Úvodem je třeba provést úvahu, zda je správné přípravky Lupidon považovat za očkovací látky ve smyslu tradičních vakcín?
Klinické údaje ukazují, že imunizace těmito vakcínami neposkytuje shodné nebo obdobné výsledky jako u běžného očkování (38-41), množství antigenu přítomného ve vakcíně je tak malé, že protilátková imunitní odpověď po tomto očkování zůstává neměřitelná (42-45) a navíc schéma očkování je významně odlišné od konvečního schématu očkování. Z toho vyplývá, že terapeutický účinek není dán s největší pravděpodobností tvorbou humorální imunitní odpovědi, ale spíše specifickou imunitní modulací. Tato teorie byla přijata mezinárodní odbornou veřejností a potvrzena publikací z roku 1988 v časopise "Journal of Infectious Diseases" (46). V publikované práci se potvrdilo, že u morčat, která trpěla recidivujícím genitálním Herpes simplex, došlo po imunoterapii k významné redukci četnosti rekurencí, aniž by byla zaznamenána významná změna neutralizačních protilátek.
Na základě těchto poznatků nelze obě vakcíny Lupidon H a Lupidon G považovat za tradiční očkovací látky, ale spíše za imunostimulanty s určitou obdobou alergenových přípravků.

Farmakodynamický účinek vzhledem k indikacím
Mechanismus působení těchto biologických přípravků nebyl dosud vyjasněn, ale je jisté, že se významně liší od mechanismu konvenčních léčiv. Nízká koncentrace antigenů znemožňuje jakékoli hodnocení týkající se farmakokinetiky vakcín. Navíc tyto údaje nejsou k dispozici.
Klinické indikace obou vakcín, které jsou určeny pro terapii rekurentních herpesimplex nákaz, jsou velmi specifické pro stanovení farmakologických vlastností. Také patogeneze těchto nákaz není dostatečně dobře známá, neboť se tato infekční onemocnění mohou objevit i u osob bez poruchy imunitního systému, u nichž cirkulační neutralizační protilátky bývají vysoké a lymfocyty vykazují dostatečnou produkci lymfomonokinů po odpovídající stimulaci. Proto je téměř nemyslitelné, že by tak nízkokoncentrační antigenní stimulace oběma těmito vakcínami mohla ovlivnit vysoké koncentrace protilátek, které se vytvářejí antigenní stimulací během samotné recidivující nákazy.
Nejpravděpodobnější hypotéza se opírá o účinek vakcín zprostředkovaný buněčnou imunitou (ať už specifickou nebo nespecifickou imunitní odpovědí). Tuto hypotézu potvrzují klinické studie, jejichž výsledkem bylo zjištění, že u většiny pacientů došlo ke statisticky významnému nárůstu celkových CD3, CD11 a CD4 lymfocytů společně s nárůstem poměru T-helper a CTL (tj. CD4/CD8) a NK buněk (CD16) vzhledem ke kontrolní placebové skupině. Tyto údaje vedou k tomu, že se vytváří buněčná imunitní odpověď po imunoterapii vakcínami Lupidon G nebo H. Nízká koncentrace antigenů v obou vakcínách Lupidon (49) by mohla být důvodem pro tento předpoklad tj., že imunita je zprostředkována právě buněčnou odpovědí. Mechanismus, kterým je tato imunitní odpověď vyvolávána, není dosud dobře prozkoumán, přestože obecné teze potvrzují skutečnost že nízkoantigenní stimulace vede k tvorbě buněčné imunity, zatímco silná antigenní stimulace spíše k humorální protilátkové imunitní odpovědi (47-48). Na základě těchto předpokladů lze objasnit, proč u pacientů, kteří mají časté rekurentní herpes simplex virové nákazy, a mívají vysoké hladiny protilátek, nedochází indukovanými protilátkami k ovlivnění průběhu tohoto onemocnění. V takovém případě mohou vakcíny Lupidon obnovit imunitní homeostázi a to podáváním malých množství antigenu v období klidu mezi infekčními epizodami. Tuto hypotézu by měla potvrdit pozorování zvýšených hladin protilátek produkovaných plazmatickými buňkami před zahájením imunoterapie a naopak pozorování zvýšení hladin specifických T buněk po ukončení imunoterapie. Bohužel tyto údaje dosud scházejí.

Obecná farmakodynamika
Studie provedené na psech, kterým byla subkutánně aplikována 41 krát koncentrovanější (než je lidská dávka) vakcína v dávce 50 ml/kg, neprokázaly žádné změny v EKG, ve funkci srdce ani plic. Podobně zkoušky na krysách a myších nevykázaly žádné systémové farmakologické účinky po parenterálním podání.

Interakce s léčivy
Farmakologické interakce s ostatními léčivými přípravky nelze očekávat vzhledem k imunomodulačnímu množství antigenu. Navíc klinické údaje potvrdily absenci těchto interakcí po dlouhodobém podávání obou vakcín.

Farmakokinetika není stanovitelná pro oba virové antigeny HSV-1 a HSV-2, protože tyto účinné látky nejsou specificky metabolizovány a jejich účinnost je spojena s ojedinělým mechanismem působení založeným na interakci s buňkami imunitního systému. Proto absorpce, metabolismus a eliminace antigenních proteinů nesouvisí s terapeutickým účinkem. Navíc ani literárně není dokumentovaná farmakokinetika virových vakcín (virových antigenů).

Ke zkouškám toxicity byly použity tyto zvířecí modely: myši, krysy a psi. Aplikované dávky, způsob podání a délka doby podávání stejně jako počty zvířat byly stanoveny tak, aby byla dosažena možná statisticky významná odlišnosti mezi léčenou a kontrolní skupinou. Všechny testy byly prováděny jak pro vakcínu Lupidon H tak pro vakcínu Lupidon G.

Akutní toxicita
Akutní toxicita byla zkoušena subkutánně na myších, krysách a psech s více než 41ti násobně vyšší koncentrací než je lidská dávka. Zkouška na myších (62) se prováděla po dobu 4 týdnů. Na konci tohoto pozorování byla provedena pitva a histologie. U všech zvířat byly sledovány tyto parametry: chování, spotřeba potravin a vody a tělesná hmotnost. Žádné příznaky toxicity nebyly pozorovány. Obdobná zkouška (61) byla provedena i se zvýšenými dávkami, tj. v rozsahu od 0 - 0,6 - 1,2 - 2,5 - 5,0 ml/kg (přitom v každé skupině bylo 20 myší). Výsledky byly podobné, a proto nebylo možné stanovit LD50. Zkouška na krysách (40 kusů zvířat), kterým byla podávána dávka vakcíny v množství 31,6 - 46,4 ml/kg (tj. 41x koncentrovanější), prokázala podobný výsledek jako na myších, tj. nebyly pozorované žádné známky toxicity (63). Stejný závěr přinesla obdobná studie na psech, kterým byla podána dávka 25 ml/kg (64).
Hodnotu LD50 nebylo možné stanovit, protože aplikované dávky vakcín (někdy v mezích maxima fyziologického objemu tolerovatelného při subktutánním podání) nezpůsobily žádné významné změny sledovaných charakteristik. I když nebyly prováděny hematologické a biochemické analýzy (kromě kompletní biochemie moči), zvýšené dávky vakcín Lupidon nevyvolávají příznaky akutní toxicity.

Toxicita při opakovaném podávání
Subakutní toxicita (do 3 měsíců)
Subakutní toxicita vakcín Lupidon byla studována na krysách (56 krys), kterým byla vakcína (20ti nebo 41ti násobně koncentrovaná dávka) podávána subkutánně každý den v dávce 2,5 ml/kg po dobu 10 dní a dalších 14 dní byly pouze pozorovány. Osmi zvířatům bylo podáváno placebo (PBS - fosfátový pufr) (65).
Obdobná zkouška byla provedena i na celkem 120 krysách, kterým byly subkutánně podávané dávky 0,2 - 0,5 - 1,0 ml/kg/den po dobu 28 dní. I v tomto případě byla jedna skupina zvolena jako kontrolní, které se podával fyziologický roztok. Celkem byly dávky 14, 36 a 70ti násobně vyšší než jedna lidská dávka. Byl sledován celkový zdravotní stav zvířat, jejich chování a úmrtnost s nekropsií. Hematologické a hematochemické testy byly provedeny na počátku studie a na jejím konci, tj. po terapii. Po ukončení studií byla všechna zvířata utracena a následně se provedly pitvy a orgánové zkoušky, včetně histologie. Žádný ze sledovaných parametrů neprokázal významnou odchylku od normálních fyziologických hodnot. Ani nekropsie či histologie nepotvrdily významné patologické odchylky. Subakutní toxicita nebyla zjištěna ani v jedné skupině léčených zvířat (66).

Chronická toxicita (nad 3 měsíce)
Chronická toxicita obou vakcín Lupidon byla zkoušena na 30 krysách, kterým se subkutánně podávaly dávky 0,1 - 0,2 - 0,5 ml/kg/den po dobu 56 týdnů (zhruba 1 rok). Během tohoto období se sledovala tělesná hmotnost, příjem potravy a vody a prováděly se obvyklé hematologické a biochemické zkoušky včetně analýzy moči. Na konci studie se provedla: nekropsie, vážení a histologie všech orgánů.
Výsledky pozorování neprokázaly žádné statisticky významné odchylky od kontrolní skupiny ve všech sledovaných parametrech (67). Stejná studie byla provedena i na psech (32 psů), kterým byly subkutánně podávány stejné dávky jako v případě krys. Rovněž výsledky této studie nepotvrdily žádné statisticky významné rozdíly ve všech sledovaných parametrech (68).
Výsledky všech studií potvrzují, že vakcíny Lupidon nevykazují známky toxicity ani po opakovaném podávání.

Reprodukční toxicita
Vliv na fertilitu a reprodukční schopnosti
Vliv vakcín Lupidon na fertilitu byl studován na krysách (96 krys). Samcům i samicím byla vakcíny podávána denně v dávkách 0,1 - 0,2 - 0,5 ml/kg. Přitom samcům se vakcína podávala 49 dní před pářením a samicím 14 dní před pářením. U samic se 24. den březosti provedla sekce. Kontrolní skupině se podával fosfátový pufr (PBS). U samců se sledovaly: hmotnost varlat, procentuální schopnost oplodnění, spermatozoidní životaschopnost. U samic se sledovala možnost oplodnění, hmotnost, vitalita a vnější malformace plodu.
Pozorování vedla k závěru, že podávání vakcín Lupidon nezpůsobí žádné patologické efekty (69).

Embryotoxicita
Studie embryotoxicity se prováděly na krysách (70) a králících (71). Denně se 60 krysám subkutánně podávala obvyklá dávka vakcíny o velikosti 0,1 - 0,2 - 0,5 ml/kg, od 6. do 16. dne březosti. Přitom se sledovaly tyto parametry: obecný stav, chování, mortalita, spontánní potrat, tělesná hmotnost v 1., 6., 16. a 20. dnu březosti.
U plodu, který byl získán císařským řezem ve 20. dni březosti, se sledovalo: počet zachycených oplodněných vajíček a počet reabsorpcí, hmotnost a životaschopnost plodů, počet úmrtí plodů nebo hyposomických plodů, výskyt vnějších, fyzických a kostních malformací plodů.
Z výsledků těchto pozorování vyplývá, že během podávání vakcín Lupidon nedochází k nepříznivému vlivu na plod ani na březost/těhotenství. Navíc nebyla pozorována žádná statisticky významná odchylka mezi léčenou a placebovou skupinou.
Stejné schéma bylo studováno i na králičích samicích v březí, kterým se vakcína podávala od 6. do 27. dne březosti. Rovněž tato studie potvrdila výsledky získané ze shora uvedené studie.

Pre- a postnatální toxicita
Ke zhodnocení vlivu těchto vakcín na vývoj plodu, porod, kojení a vývoj mláděte samice krys v březí byly rozděleny do 4 skupin (po 20 kusech). Všechny samice byly denně imunizovány subkutánně dávkou 0,1 - 0,2 - 0,5 ml/kg od 16. dne březosti do 3. týdne laktace. Byly zaznamenávány tělesné hmotnosti samic, novorozených mláďat a případné malformace. Tělesná hmotnost novorozených mláďat byla stanovena ve 14. a 21. dni. Zjištěné údaje u pozorovaných samic i jejich mláďat nevykazovaly žádnou změnu vzhledem ke stejným údajům kontrolní skupiny; navíc nebylo zaznamenáno žádné úmrtí, žádný rozdíl v březosti (tj. počtu mláďat a počtu živých mláďat) (72).

Genotoxicita: In vitro testy
Mutagenní potenciál byl studován reverzní mutací na Salmonella typhimurium pomocí Ames testu (52, 53, 54, 55, 56). Před hodnocením mutagenity byla stanovena baktericidní aktivita, která je nezbytná pro správné stanovení testu mutagenity na Salmonella typhimurium. Toto hodnocení poskytlo dostatečně průkazné výsledky o kvalitativní absenci mutagenního potenciálu obou vakcín, zatímco kvantitativní hodnocení ukázalo, že dávky 400 µl/jamka vyvolaly zvýšenou reverzní frekvenci pouze jednoho kmene. Přesto lze na základě těchto testů potvrdit absenci mutagenního potenciálu obou vakcín Lupidon (73).
Dále byly provedeny dodatečné testy obou vakcín Lupidon, tj. schopnost genové konverze na Saccharomyces cerevisiae (kmen D4), genová mutace na Schizosaccharomyces pombe (kmen P1). Oba tyto testy umožnily stanovit genetickou reverzní mutaci na genu TPR5 a genu ADE2 Saccharomyces cerevisiae. Výsledky zvyšují průkaznost o absenci genotoxicity obou vakcín Lupidon (73).

Genotoxicita: In vivo testy
Testy s Saccharomyces cerevisiae se rovněž používají pro stanovení genetické reverzní mutace metabolizovaných produktů vylučovaných močí a na hostitelsky zprostředkovaných zkouškách: tyto testy umožní stanovit, zda potencionální mutagenita přípravku pochází ze samotného přípravku nebo z katabolitů přítomných ve zvířecí moči nebo pobřišnice (74). Výsledky obou testů neprokázaly žádné mutagenní účinky obou vakcín Lupidon. Mikronukleární test je selektivní barvení chromozomálních excentrických fragmentů, které se neoddělily během anafáze: toto je další metoda, která byla použita ke zhodnocení genotoxicity na myších, kterým byla podávána vakcína v dávce 0,1-0,3-1,0 ml/kg (75). DNA reparativní test (76) měří hladiny nenaprogramované DNA syntézy (tj. DNA syntézy, ke které nedochází během S fáze) v buňkách, které byly vystaveny mutagennímu agens. Tento test je spolehlivým měřením fyziologické syntézy DNA, neboť k syntéze dochází v případě opravy poškozené chromozomální DNA způsobené mutagenními činiteli. Oba dva testy neprokázaly žádnou změnu po podávání obou vakcín Lupidon. Všechny testy potvrdily absenci genotoxicity obou vakcín Lupidon.

Onkogenní/Karcinogenní potenciál
Studie karcinogenese (77) byla provedena na 600 krysách rozdělených do 4 léčených skupin a 2 kontrolních skupin. Pozorování se provádělo 24 měsíců s následným uskutečněním makro a mikroskopických vyšetření na různých orgánech a v místě očkování. Podrobný experiment potvrdil absenci karcinogenního potenciálu obou vakcín bez ohledu na následující skutečnosti:
- používané virové kmeny byly certifikovány expertem (Dr. Fred Rapp, Státní univerzita v Pennsylvanii), že nemají karcinogenní potenciál (Reinbeker Kolloquium, Tel Aviv 1976) (56),
- Herpes simplex 2 je známý tím, že ztrácí svůj karcinogenní potenciál po tepelné inaktivaci,
- prof. Petersen ve své publikaci (57) potvrdil, že podávání obou vakcín 2000 novorozeným morčatům nezpůsobilo žádné onkogenní změny,
- je nepravděpodobné, že velmi malé dávky obou antigenů přítomných ve vakcínách by mohly indukovat karcinogenní efekt ve srovnání s všudypřítomným výskytem obou herpes simplex antigenů v okolí.